Estímulos mecânicos ativam a expressão gênica através de uma via de detecção de estresse no envelope celular

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13979 (2023) Citar este artigo

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Mecanismos mecanossensíveis são frequentemente usados para detectar danos à estrutura do tecido, estimulando a síntese e o reparo da matriz. Embora este tipo de processo mecanorregulador seja bem reconhecido em sistemas eucarióticos, não se sabe se tal processo ocorre em bactérias. No Vibrio cholerae, o dano induzido por antibióticos na parede celular de suporte promove aumento da sinalização pelo sistema de dois componentes VxrAB, que estimula a síntese da parede celular. Aqui mostramos que mudanças no estresse mecânico dentro do envelope celular são suficientes para estimular a sinalização VxrAB na ausência de antibióticos. Aplicamos forças mecânicas a bactérias individuais usando três modalidades de carregamento distintas: carregamento de extrusão dentro de um dispositivo microfluídico, compressão direta e pressão hidrostática. Em todos os casos, a sinalização VxrAB, conforme indicado por um repórter de proteína fluorescente, foi aumentada em células submetidas a maiores magnitudes de carga mecânica, portanto diversas formas de estímulos mecânicos ativam a sinalização VxrAB. A redução na rigidez do envelope celular após a remoção da endopeptidase ShyA levou a grandes aumentos na deformação do envelope celular e aumentou substancialmente a resposta do VxrAB, apoiando ainda mais a capacidade de resposta do VxrAB. Nossas descobertas demonstram um sistema regulador de genes mecanossensíveis em bactérias e sugerem que os sinais mecânicos podem contribuir para a regulação da homeostase da parede celular.

As forças mecânicas têm sido reconhecidas há muito tempo como contribuintes essenciais para o crescimento e função dos organismos. Nos sistemas de mamíferos, as forças mecânicas regulam uma ampla variedade de processos, incluindo diferenciação celular durante o desenvolvimento1,2, início e progressão da doença3 e homeostase tecidual4. Em tecidos e órgãos com funções de suporte de carga, as forças mecânicas muitas vezes atuam como o sinal primário que inicia a remodelação e reparação do tecido, permitindo assim que o tecido se adapte aos desafios mecânicos do ambiente e retorne rapidamente ao suporte de carga. A remodelação tecidual mantém assim a homeostase da função mecânica, equilibrando a remoção do tecido danificado com a síntese tecidual. Estruturas de suporte de carga, incluindo ossos5, vasos sanguíneos6 e o citoesqueleto vegetal7,8, utilizam mecanismos mecanossensíveis para manter a função mecânica.

A maioria dos estudos de mecanobiologia concentra-se em sistemas eucarióticos9, embora evidências recentes tenham destacado a importância das forças mecânicas em procariontes. Nas bactérias, apêndices extracelulares, incluindo flagelos e pili tipo IV, estendem-se do corpo celular para detectar e responder a estímulos mecânicos do ambiente. A montagem e desmontagem da unidade motora flagelar responde a aumentos e diminuições na carga mecânica externa10,11. A inibição física da rotação flagelar pelo contato com uma superfície gera forças de reação dentro do motor molecular, que estimulam a adesão superficial e a formação de biofilme . Pili tipo IV são fibras motorizadas que se estendem e retraem para interagir com o ambiente. Além disso, a mecanossensibilização por pili Tipo IV promove a formação de biofilme14 e a liberação de fatores de virulência15, além de orientar a motilidade após colisões16.

O envelope celular é o principal componente de suporte das bactérias e também é sensível a forças mecânicas. Os canais iônicos ativados por estiramento dentro da membrana celular respondem rapidamente a mudanças na osmolaridade abrindo-se devido ao estiramento da membrana, levando ao aumento da sobrevivência após choque hipo-osmótico . O estresse mecânico e a tensão dentro do envelope celular também afetam a montagem de complexos de efluxo trans-envelope; por exemplo, a montagem e a função da bomba de efluxo multicomponente trans-envelope CusCBA são prejudicadas por aumentos na tensão de cisalhamento octaédrico dentro do envelope celular . O estresse mecânico dentro do envelope celular também afeta os locais de inserção da nova parede celular em bactérias submetidas à flexão, com maiores quantidades de parede celular inseridas em regiões de maior tensão de tração . Embora estes mecanismos mecanossensíveis dentro do envelope celular sejam bem reconhecidos, nenhum dos mecanismos identificados até à data demonstrou regular a expressão genética relacionada com a remodelação da parede celular, um componente essencial do envelope celular. Foi levantada a hipótese de que os sistemas reguladores de genes atualmente associados a outras formas de estresse celular também podem ser mecanossensíveis21 e um relatório recente sugere que o confinamento aumenta a sinalização de Rcs e a subsequente resistência ao bacteriófago em E. coli22. Se mecanismos mecanossensíveis estiverem envolvidos na remodelação e homeostase do envelope celular, seria de esperar que o estresse mecânico e a deformação regulassem a síntese de componentes do envelope celular.

50 MPa) causes changes to RNA synthesis and DNA replication and can cause cell death35; here we apply mild hydrostatic pressure of 0–100 kPa (a bacterium 10 m underwater experiences approximately 100 kPa hydrostatic pressure), in contrast a cell leaving a host gastrointestinal system and entering brackish water is expected to experience an increase in turgor pressure of 500 kPa. Hydrostatic pressure increases the compressive stresses perpendicular to the cell envelope. The magnitude of mechanical stresses caused by hydrostatic pressure are typically much smaller than the hoop and longitudinal stresses (oriented parallel to the cell envelope surface) generated by extrusion loading or compression, but under conditions of applied hydrostatic pressure can become noticeable. Hydrostatic pressure was applied to cells suspended in liquid media in a custom chamber connected to a microfluidic pump. After 2 h of incubation at room temperature, cells were removed and visualized. Average cell fluorescence increased 28% with increasing magnitude of applied compression force (Fig. 2E, left), supporting the idea that VxrAB signaling is also sensitive to hydrostatic pressure. Upon deleting the vxrB box in the promoter, cell fluorescence did not vary with applied hydrostatic pressure (Fig. 2E, right), confirming that the mechanosensitive increase in cell fluorescence for PmurJ:msfGFP cells required VxrB activation. As in the compression experiments, the PvxrAB:msfGFP reporter strain were consistent with the observations with PmurJ:msfGFP (Fig. 2F). The variance in fluorescence was greater than that seen in compression loading, a finding we attribute to the fact that mechanical stresses in the cell envelope are limited to radial compression and are not as well controlled (cell contact with the walls of the device and other cells is completely uncontrolled). As a result, the mechanosensitive response to hydrostatic pressure was dominated by a subset of cells (upper portion of cell population in Fig. 2E,F). We conclude that VxrAB signaling is responsive to diverse methods of applying mechanical load to the cell envelope./p> 0.80 µm) so the cells could flow freely through all of the feeder channels and would only get stuck in the narrow constriction of the tapered channels. The feeder channel etch depth was characterized using a profilometer (P-7, KLA Inc, Milpitas CA, USA). The profilometer tip was too wide to measure the tapered channels, so an atomic force microscopy high aspect ratio tip was used to measure the etch depth of tapered channels (Veeco Icon Bruker, Billerica MA, USA). Channel etch depth was 0.88 ± 0.03 µm. A scanning electron microscope (Zeiss Ultra 55 SEM microscope, Oberkocken Germany) was used to measure the tapered channel inlet width (1.48 ± 0.07 µm) and outlet width (0.35 ± 0.02 µm). The tapered channel inlet is wide enough that cells can enter, and the outlet is narrow enough to prevent cells from flowing out./p>